Cette année a été très particulière pour tous, afin de s’adapter, Interchim® a mis en place un laboratoire afin de pouvoir réaliser des démonstrations en ligne. Ces démonstrations peuvent s’articuler autour de purifications de produits « standards » afin de démontrer le potentiel de nos instruments, cependant, quand on souhaite acquérir un système de purification, il est légitime de vouloir purifier son produit. C’est exactement ce que nous pouvons faire dans notre laboratoire et nous souhaitions vous en faire partager un exemple à travers cet article.

L’installation

Pour cette démonstration en ligne, il nous fallait purifier un peptide issu d’une synthèse chimique. L’appareil sélectionné a donc été tout naturellement le puriFlash® 5.250P. Pour suivre cette purification, nous utiliserons un détecteur UV ainsi que notre spectromètre de masse puriFlash® MS.

La détection de peptides par spectrométrie de masse se fait avec une source ESI idéale pour la détection de grosse molécule comme les peptides. Afin de permettre cette détection, une infime quantité de produit est « détournée » par notre interface MS, afin d’être passée sur ce mode de détection.

 

Injection directe du mélange à purifier sur le spectromètre de masse puriFlash® MS (FIA), sélection des paramètres de sources.

  • Source type: ESI
  • Source parameters:
    Mode : Positif
    Capillary temperature : 200°C
    Capillary voltage : 160V
    Source voltage offset : 30 V
    Source voltage span : 5 V
    Source gas temperature : 250°C
    ESI voltage : 3500V

Les résultats suivants ont été obtenus :

Resultat injection directe du mélange à purifier sur le spectromètre de masse puriFlash® MS

Nous observons un pic à m/z 643, qui correspond à la molécule d’intérêt chargée 3 fois (M+3H)3+ ainsi qu’un pic à m/z 964,3 qui correspond à la molécule d’intérêt chargée 2 fois (M+2H)2+.

 

Conditions analytiques

Pour effectuer cette purification, nous avons réalisé une transposition sur une colonne HPLC préparative à partir d’un développement fait sur une colonne HPLC analytique.

  • Solvants:
    A: Eau + 0,1%FA
    B: ACN
  • Colonne HPLC : Onyx Monolithic C18 50x2mm
  • Débit : 0,6mL/min
  • Volume injecté : 5µL (Concentration 1mg/mL)
  • Conditions d’élution:
    T (min) A % B %
    0 95.0 5.00
    3.8 0.0 100
    3.81 0.0 100
    4 0.0 100
    4.07 95.0 0.0
    4.2 95.0 0.0
    4.3 95.0 0.0

     

Chromatogrammes :

Chromatogrammes

 

Transposition & purification

Nous avons choisi d’utiliser une colonne de la gamme peptide avec la colonne préparative PFB5C18T-150/212.

Dans un premier temps, nous avons réalisé la transposition de la méthode HPLC analytique vers une méthode HPLC préparative.

  • Device: puriFlash® 5.250P + MS
  • Solvents:
    A: Water + 0,1%FA
    B: Acetonitrile
  • Column: PFB5C18T-150/212
  • Flow rate: 16mL/min
  • Injection mode: Liquid
  • Injection volume: 1mL
  • Concentration: 1mg/mL
  • Crude sample: 1mg
  • Detection: UV 214nm (purple)
T (min) A % B %
00:00 95.0 5.00
20:00 0.00 100

Transposition de la méthode HPLC analytique vers une méthode HPLC préparative

Puis nous avons augmenté la concentration de l’échantillon injecté afin de pouvoir purifier un maximum de produit en un seul “run”.

Quantité injectée : 1mL (concentration 25mg/mL)

  • Device: puriFlash® 5.250P + MS
  • Solvents:
    A: Water + 0,1%FA
    B: Acetonitrile
  • Column: PFB5C18T-150/212
  • Flow rate: 16mL/min
  • Injection mode: Liquid
  • Injection volume: 1mL
  • Concentration: 25mg/mL
  • Crude sample: 25mg
  • Detection: UV 214nm (purple),
    UV 254nm (green)
    Mass XIC 644m/z (Orange),
    Mass XIC 964m/z (Blue)
  • MS split parameters
  • Valve rotation: 0,5s
  • Make-up flow-rate: 0,5mL/min
  • Dilution flow-rate: 0,5mL/min
  • Solvents for make-up and dilution: Acetonitril + 0,1% FA
  • Pressure:60bar
  • Elution conditions:
T (min) A % B %
00:00 95.0 5.00
20:00 0.00 100

Transposition de la méthode HPLC analytique vers une méthode HPLC préparative

Grâce au système puriFlash® PF-5.250P couplé au puriFlash® MS nous avons donc pu purifier et collecter le produit d’intérêt en se basant sur sa masse.

 

Confiner ? Besoin d’une démonstration mais sans possibilité de faire venir des fournisseurs ? Interchim® met en place des systèmes de démonstration par visio-conférence.

Dans nos laboratoires, nous pouvons mettre en place nos systèmes afin de purifier vos produits lors de démonstration en ligne. Vous pourrez alors profiter d’une expertise privilégiée lors de la démonstration.

 

En savoir plus :